Використання тест-систем для оцінки загальної антиоксидантної активності насіння

Анотація

Вступ. Метод DPPH•(з використанням вільного радикалу), є одним з розповсюджених непрямих методів оцінки загальної атиоксидантної активності (ЗАА). DPPH• не реагує з флавоноїдами, які не містять гідроксильних груп у В-кільці, а також з ароматичними кислотами, що містять тільки одну гідроксильну групу. Метод базується на властивості стабільного радикалу 2,2-дифеніл-1-пікрлгідразілу (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl – DPPH•) реагувати з донорами протонів, включно з фенолами.

Основна мета роботи полягала в апробації тест-системи DPPH• для проведення оцінки ЗАА насіння при масовому аналізі (проведення скрінінгу генофонду України і селекційного матеріалу).

Обговорення результатів. Визначення антирадикальної активності проводять з використанням стабільного радикалу (DPPH•) у відповіднсті до методики, представленоїS.Arabshahi, A.Urooj (2007), але з деякими змінами: метиловий спирт векстрагуючому розчині було замінено на нетоксичний етиловий; концентраціюDPPH• було обрано таким чином, щоб максимальна екстинція розчину не превищувала 1,4 од. та світлопроникність всіх розчинів знаходилась у межах лінійного участку калібрувального графіка. Час реакції було збільшено з 30 хв. до 2 годин, для зменшення впливу коливань температури в приміщенні лабораторії (від + 13^°С до + 30^°С) та збільшення кількості зразків, що аналізували в одному досліді, до 32 (у трьох повтореннях).

У результаті проведених чисельних експериментів було прийнято наступний хід проведення аналізів. Насіння додатково підсушують у термостаті при 25 ^°С впродовж 4–5 діб. Зразок розмелюють на лабораторному млиночку впродовж 1 хв. (3× 20 сек). Борошно, наважкою 0,5 г, кладуть у віали (з кришками, які герметично закриваються), заливають 4,5 мл 80% розчином етанолу в дистильованій воді і екстрагують 18–20 годин в темряві при кімнатній температурі. Проби центрифугують (10 хв. при 3000 × g) на ОПН-3, а потім по 2 мл надосадного розчину переносять у чисті віали. Спиртовий розчин радикалу готують наступним чином: розчинюють 22 мг DPPH•у 400 мл 80 % етанолу на магнітному розмішувачі при розсіяному світлі, а невеликі частинки барвника, що не розчинився, додатково розтирають порцеляновим товкачиком. Розчин фільтрують і зберігають впродовж дня проведення досліджень. Перед початком аналізу проводять вимірювання оптичної щільності розчину, що обув отриманий після додавання 0,5 мл
80 % розчину етанолу до 3,5 мл розчину DPPH• на спектрофотометрі при 517 нм. Якщо екстинція перевищує 1,4 од., то розчин додатково розбавляють 80 % розчином етанолу так, щоб його екстинція дорівнювала 1,4 од. (робочий розчин DPPH•, приблизно 125 мкМ). До 3,5 мл робочого розчину DPPH• додають 0,5 мл екстракту насіння при кімнатній температурі, швидко перемішують, розміщують у темному місці на 2 години і реєструють зміну світлопоглинання розчину. У контрольному зразку до 3,5 мл робочого розчину DPPH• додають 0,5 мл 80 % етанолу. Здатність зразка нейтралізувати стабільний вільний радикал DPPH• (антирадикальна активність – АА) визначали як: АА=(A−B)/A×100%, де А – світлопоглинання контрольного зразка, В – світлопоглинання робочого зразка (через 2 години після змішування з робочим розчином радикалу DPPH•). В якості стандарту антиоксидантної активності використовували хлорогенову кислоту і ЗАА передавали в мг хлорогенової кислоти на 1 г зразка. В випадку проведення аналізу ЗАА насіння зернових з дуже високими значеннями цього показника, необхідним є зменшення кількості екстракту що додається до розчину DPPH•, наприклад, 0,2 мл. В цьому випадку необхідно зробити новий калібровочний графік стандарту.

Висновки. За останні роки спрямованість використання методів установлення антиоксидантної активності поступово виходить в бік розробки і використання простих і не вартісних методів оцінки великої кількості біологічних зразків. Це викликано не тільки зростаючою цікавістю як спеціалістів харчової промисловості, так і дієтологів до пошуку нових джерел цінних продуктів харчування, але й необхідністю проведення скринінгу рослинного генофонду з метою виділення найбільш перспективних зразків для біофортифікації